病毒ldquo斗士rdquo细菌 [复制链接]

年11月5日以色列魏茨曼研究所的RotemSorek教授及其团队在《Cell》上发表了一篇名为“BacterialRetronsFunctionInAnti-PhageDefense”的文章。该文章一经发表就引起了科学界的轰动，因为Retrons（反转录子）和CRISPR一样发现在细菌体内，且具有抵抗噬菌体的防御功能，科学家们认为这些反转录子或许能与CRISPR整合在一起发挥更大的基因编辑功能。

Retrons早在年就被发现，源于科学家在细菌体内发现的大量的多拷贝单链DNA（msDNA），后来他的形成过程及结构逐渐被解析：Retrons是由两部分组成的，一是一段非编码RNA（ncRNA），二是逆转录酶（RT）。非编码RNA经过折叠形成了msr和msd两部分，在msr与msd互补配对的末端有两个保守的非配对鸟苷残基。RT则能够识别非编码RNA，并以msd为模板，从鸟苷残基的2’-OH开始进行反转录，并且存在RNaseH可以降解msd，当完成反转录后，就形成了一个RNA与DNA的共价结合的结构，即msDNA（图1）。

图1

虽然Retrons的结构以及形成过程已经被大家所了解，但是在过去的几十年中关于Retrons的作用并未为人所发现，而在本文中作者证明了他是细菌抗噬菌体防御系统中的组成部分，具有广泛的噬菌体抗性。

作者最开始的工作灵感来源于最近的文献报道，是一篇关于RT参与噬菌体的防御过程。于是作者想要找到新的参与噬菌体防御的RT，而细菌免疫相关的基因往往都会集中在基因组上一个叫做“防御岛”的区域，因此作者的搜寻也集中在这个地方。通过寻找，作者在多种细菌的“防御岛”上发现了一个含有RT的保守双基因盒。而在这个Newsystem中，除了RT之外，同时存在一个OLD-familyendonuclease，并且在这两种酶之间还编码了一段基因（图2B）。为了证明这段序列是一段ncRNA，作者做了RNA-Seq，发现这段区域的表达丰度较高（图2D），同时二级结构预测也显示出与ncRNA结构的高度相似性（图2E），提取的细菌内DNA也显示出确实产生了一条大约70-80nt的ssDNA（图2F）。将这个Newsystem克隆至大肠杆菌中也具有明显的噬菌体抗性，该Newsysterm中三个重要组分的任何一个部分发生突变均会导致对噬菌体的抗性消失（图2C，2G）。由此可知作者发现了一个新的未曾报道过的具有噬菌体抗性的Retron，根据命名规则作者将其命名为Retron-Eco8。

图2

这个鉴定出来的新防御体系就让作者产生了进一步的思考，仅仅只是这个新型的Retron具有抵抗噬菌体的特性，还是在细菌的基因组中广泛存在这样具有抗性的Retrons呢？于是作者就在约3,细菌和古细菌防御岛上搜索RT蛋白的同源物，再利用层次类聚法将其分为8个进化枝，发现其中有6个进化枝都显示出与防御有强烈相关性（图3A）。

图3

并且在这个过程中作者发现反转录子的结构，除了先前所述的非编码RNA与逆转录酶两个必须部分外，还有另外编码的一种或多种蛋白，作者将这些部分称为“Effectors”，并将他们发现的10种效应子做出分类。而为了验证这些Retrons是否具有抗噬菌体作用，作者克隆了11种反转录子至大肠杆菌中，再用多种噬菌体进行侵染，其有8个都对噬菌体有一定抗性，有的反转录子甚至对多种噬菌体都具有抗性。而为了说明效应子在其中所起的作用，作者又针对Ec73和Ec48两种反转录子分别突变了效应子的关键位点，可以发现，当效应子发生突变后，大肠杆菌将对噬菌体不再具有抵抗性。对于RT的突变也是有同样的结果。由此我们可以知道效应子在整个Retrons结构中是必不可少的，并且需要与逆转录酶共同作用才能发挥噬菌体抗性（图4）。

图4

那Retrons究竟是如何保护细菌免受噬菌体的侵袭的呢？作者发现很多的效应子也同时出现在CBASS抗噬菌体防御系统中，在CBASS中，这些效应蛋白在接收到噬菌体感染的信号后会出现流产感染的现象。流产感染本质上是一种细菌自杀，从而导致被感染细菌的代谢停止，噬菌体无法在细菌内完成一个完整的复制周期，也就不会有新的组装好的噬菌体重新感染其他细菌。

那既然都拥有着相同的效应子，很可能都是效应子产生作用完成了对噬菌体的防御，于是作者就推测反转录子也是通过流产感染的方式实现了抗噬菌体。如果是这样，那我们可以假设，当MOI足够高，保证每个细菌都有噬菌体进入，那么所有的细菌都会进入生长停滞状态。为了验证这一猜想，作者就用不同的MOI感染了含反转录子的细菌，记录细菌生长情况。当感染复数为2时，无反转录子的细菌很快死亡，而含有反转录子的细菌虽然无法继续生长，但并没有死亡，而是进入了一种生长停滞状态。为了进一步了解流产感染过程，作者又着重研究了Ec48反转录子。Ec48反转录子中存在的效应子是两个跨膜螺旋蛋白，这种效应蛋白会破坏膜的完整性，使细胞膜变得可渗透。于是作者用噬菌体感染带有Ec48的细菌，并观察不同时间点细胞状态，发现随着感染时间的增加，细菌不会破裂死亡，并且在感染15min后膜通透性就开始发生改变。从而证实噬菌体没有在这些细胞内完成复制周期（图5）。

图5

了解到Ec48的防御方式后，作者继续进行更近一步的探索，想要阐明Ec48识别并减轻噬菌体感染的机制。作者找到了能够抵抗到Ec48的噬菌体突变体，并进行全基因组的测序，发现在λ-vir噬菌体突变体和T7噬菌体突变体中发生突变的蛋白具有相同的生物学功能，那就是可以形成RecBCD蛋白抑制剂。这种RecBCD复合物在DNA修复以及抗噬菌体活性中具有重要作用，可以说他是细菌细胞中的中心免疫枢纽。而作者的研究发现，Ec48是通过识别RecBCD的完整性来控制防御系统的，当噬菌体入侵时，噬菌体会释放出RecBCD抑制子，Ec48识别不到完整的RecBCD，于是启动防御，抵抗噬菌体（图6）。

图6

综上，作者的研究解决了几十年来的疑问，证明了Retrons具有抗噬菌体作用。并且更加深入了解了Retrons的结构由三部分构成，ncRNA，RT以及effectors。其次作者研究了Ec48的工作机制，发现他主要是通过监控RecBCD结构的完整性来发挥作用的。未来我们希望Retrons将会是精确、高效的基因组编辑工具，但这仍需更进一步地探索并加以应用。